luciferase荧光素酶检测-luciferase

为取得最佳测定效果，在用单管的荧光测定仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内，例如30秒内。

由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。一般来说，如果不分装使用三次(期间冻融三次)，对测定结果无明显影响。

样品和测定试剂混合后，必须等待1-2秒，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情况也可以测定更长或更短时间，但是同一批样品最好使用相同的测定时间。

为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测;也可以同时转入β-半乳糖甘酶报告基因质粒作为内参，然后采用β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒进行检测。采用荧光素酶报告基因检测试剂盒中的报告基因细胞裂解液裂解获得的样品，可以直接用于β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒中的测定。

影响荧光酶活性的因素很多，温度，PH值，培养基里的酚红含量，注意荧光素必须要避光保存，否则发光减弱。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作

什么是荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因？

双荧光素酶指的是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，萤火虫荧光素酶在ATP、Mg2+和O2存在的条件下，将萤火虫荧光素催化发光。海肾荧光素酶以腔肠素为底物，在氧分子存在的条件下催化腔肠素氧化发光，此过程中发出最强波长在465 nm左右的生物荧光。双荧光素酶可用于启动子结构和活性的分析、信号通路是否激活分析、转录因子同其调控序列的作用验证等。

微生物是怎样获得所需ATP的?

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，具有检测灵敏度高，没有信号背景，并且不损害植物的优点。

来自维多利亚水母的绿色荧光蛋白（green：fluorescent：protein，GFP）是一种由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分子量27ku。它的特点是无需额外添加任何底物、酶、辅助因子等物质，也没有种属、组织和位置特异性，该基因是目前惟一在细胞内稳定表达且检测简单，结果真实可靠的新型报告基因，只要暴露于395nm的远紫外光或490nm的蓝光下便可受激而发出绿色荧光（508nm）。

通过突变与重新合成，将水母的密码子换成植物偏爱的密码子，GFP基因在植物中的表达效率与稳定性提高。而且，含此修饰GFP基因的转基因植物不仅形态正常，而且完全可育。

双荧光素酶报告基因实验原理

我这里有一篇文献是关于ATP荧光技术检测细菌生长的

《荧光快检：生物传感器的应用不是梦——访沈阳中科靓马生物工程有限公司技术总监金振华教授》

ATP荧光法是根据萤火虫发光原理开发的快速检测技术。萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂，萤火虫荧光素酶（简称虫光素酶，luciferase）、虫荧光素（D-luciferin）以及ATP(三磷酸腺苷，所有细胞生物都能产生的能源物质)。在有氧条件下，虫荧光素酶催化虫荧光素生成氧化荧光素并发出荧光。如果具备上述条件，即使在萤火虫体外的系统也可以发出荧光。早在20世纪50年代末，美国太空总署就已经利用萤火虫荧光素酶建立了快速超微量ATP检测技术，60年代末曾对地球土壤样本的ATP进行了检测，并分别在日后探测月球、火星是否存在生命中得到应用。基于虫光素酶的ATP检测商业应用则始于80年代后期。最初，是通过养殖萤火虫幼虫获得虫光素酶，随着基因工程技术的发展和应用，科学家从萤火虫细胞中取出编码萤火虫酶的基因，并将其引入细菌细胞。这样，通过生物发酵在短短的十几个小时内就可以得到大量的虫光素酶。

2003年沈阳中科靓马引入由中科院发育所金振华教授发明的“含荧光素酶基因的新型菌株及虫光素酶的生产”专利项目，经过几年的产业化探索，终于在2005年后开始批量生产拥有自主知识产权的虫光素酶、虫荧光素制剂，并于2007年完成相关检测产品的配套，实现了食品样品的细菌总数快速检测。基于虫光素酶的ATP荧光检测原理虫光素酶只有在ATP存在时才会催化虫荧光素发生反应，并产生荧光。因此，如果在虫光素酶、虫荧光素过量的情况下，萤光强弱将只取决于反应系统中ATP的数量。以样品中细菌检测为例，细胞数越多，ATP数量也越多，发出的荧光就越强。也就是说，在特定条件下，荧光值与ATP的数量是呈线性相关的；而且，荧光值很容易通过光度计准确计量。所以，在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，只要得到相对荧光值和细菌细胞数的关系曲线，然后根据纯ATP的相对荧光值与细胞数的标准曲线，就能快速确定样品中细菌的细胞数。

ATP快检系统的组成部件及其作用目前，依据萤火虫发光原理并用于生物量、酶和代谢产物检测的应用系统已经有很多种。尽管各类检测系统的应用目的、操作方法、样品来源各不相同，但在组成上都包括以下几个部分。

1．试剂系统试剂系统包括促使荧光反应发生所需的所有反应试剂和ATP有效提取试剂。具体包括体细胞裂解试剂组、细菌细胞裂解试剂组和荧光反应试剂组。体细胞裂解试剂组可以专一有效地裂解样品中的非细菌细胞（体细胞）并释放ATP出ATP，然后通过过滤比色杯底部的滤膜将其排除。细菌细胞裂解试剂组主要作用是，有效地裂解细菌细胞并释放出ATP以便检测。同时，为了避免ATP降解而影响检测结果的真实性，细菌细胞裂解试剂应能使ATP降解的酶迅速失活。荧光反应试剂组则包括能与样品中细菌ATP相互作用并发出荧光的虫萤光素和虫光素酶。

2．取样器及样品预处理装置该部分包括可以定量取得不同物理状态待检样品的取样器，用于加压排出体细胞ATP的加压器、供反应用的带膜比色杯，杯架以及用于样品浓缩的专用浓缩器等。

3．微量光度计微量光度计，即微量荧光检测仪器。按具体需要，光度计除了用于计量、显示荧光值的屏幕外，还具备与个人电脑或自动打印机联用的外接口，以便记录、储存有关数据资料以供产品质量或卫生监控趋势分析。

ATP快速检测技术的优势一般来说，要实现快速检测有赖于待检样品在反应过程能够产生易于检测的声、光、磁等信号。ATP荧光快速检测就是由于产生了容易检测的荧光而实现的。在卫生监测方面，它具有常规检测无法比拟的优势。实践和文献资料都表明，用快检系统检测到的荧光值，即总ATP值（指来自细菌和事物残渣两部分的ATP）作为卫生监测指标，无论是“时效性”或实际效果都大大优于通过目测或细菌平皿计数的效果。因此，有观点认为，可以用ATP的总量作为判断卫生状况是否良好的一个标准。

1．快速、准确常规平皿计数法检测细菌总数，是让细菌在LB培养基上培养成肉眼可见的细菌菌落。由于样品稀释不均等原因，一个菌落往往由两个或多个细菌细胞构成，而且LB培养基只适合需氧或半需氧细菌的生长。因此，只能得到此类细菌的数量。采用ATP荧光快检法可检测到所有细菌、真菌和藻类，且1-5分钟即可得到实时检测结果，操作简单，时间短。平皿计数法则需要1-5天，所得结果难以反映实际卫生状况。

2．样品量少由于虫光素酶对ATP的反应非常灵敏，通过发光反应能够检测低于0.1皮克分子（10-12mol）ATP，因此，可用于低细菌含量样品的检测。例如经过0.45um膜过滤除菌后的啤酒细菌含量很低，不是常规方法所能检测出的，而通过ATP荧光法的浓缩处理可以检出。ATP快速检测技术的应用“ATP荧光法细菌总数快速检测系统”在全程监测中的应用自20世纪90年代至今，根据萤火虫发光原理研发成功并投放市场的产品已有多种，如中科靓马开发的“ATP荧光法细菌总数快速检测系统”可用于食品、饮料、乳品加工生产的全程监测：在生产加工前，可用于生产设施清洁、消毒效果的检测，原辅料细菌总数的检测；在加工生产过程中，可用于生产设备关键控制点（例如供水、通风阀门）的卫生学监测，影响乳品发酵饮料、酒类特殊微生物总数的检测；在加工生产后，可用于成品污染细菌总数的检测。另外也可用于环保、水政、海关检疫等执法部门对各种样品中微生物（细菌总数）的快速检测。ATP快检在HACCP中的应用通过对食品生产线或周边卫生环境的研究发现，如果用平皿计数法得到的生产线上某点的细菌总数很少或无菌，而通过ATP荧光检测法得到的ATP值很高，那么该检测点在之后容易大量滋生微生物。经过分析后认为，通过ATP荧光检测得到的ATP总值来自残渣和微生物两部分。并且多数情况下，来自微生物的比例较小。因此，可以通过ATP荧光检测的ATP值判断检测点是否会被重新污染，而不必通过依据细菌细胞ATP值折算的细菌菌落总数来判断，但是关键是要确定不同生产线不同检测点的ATP临界值。据此，发达国家已经将ATP荧光法检测用于HACCP中，对食品原料及经过清洁、消毒后的食品原料接触表面是否达到卫生标准做出评估；然后对容易引起微生物污染的关键部位实施重点监控。例如，通过ATP快速检测，可以判断已经达到卫生标准的部位或表面，在常规消毒后到新一轮生产的间歇时间，是否存在污染的可能性；进而制订出既符合本单位情况，又符合卫生要求的ATP数值范围。掌上ATP快速检测仪的应用目前，掌上ATP快速检测仪已经应用于生活的方方面面，在食品方面的应用主要是对饭店、列车上的餐具进行卫生状况的检测。我国铁道部决定，在2008年奥运会之前，将在列车上采用沈阳中科靓马生物工程有限公司掌上快速检测仪代替之前采用间接检测氯离子的方法对餐具进行卫生检测。此外，基于虫光素酶的ATP快速检测还可应用于其它更多领域和目的的检测，如用于自来水检测、桶装水无菌状况的检测、部队野战饮食中炭疽杆菌的检测及环境监测、临床检测等。

如何使用多功能酶标仪检测双荧光素酶

双荧光素酶报告基因实验原理具体如下：

双荧光素酶报告基因实验原理是利用双荧光素酶作为荧光素酶的标记来研究基因表达与调控的机制。双荧光素酶报告基因实验是一种基因表达定量分析技术，通过将双荧光素酶Luciferase作为报告基因插入到需要研究的靶基因启动子区域或转录后区域，使其与靶基因协同表达。

当荧光素基质（Luciferin）被添加时，双荧光素酶催化荧光素基质的氧化反应产生可检测的光信号，从而定量地测定报告基因的活性水平。首先需要将双荧光素酶编码序列克隆到适当的表达载体中，然后将其导入目标细胞中，使其与靶基因表达协同进行。

接着将荧光素基质添加到细胞中，通过检测产生的光信号来定量测定报告基因的表达水平。该技术具有高灵敏度、精准度高、重复性好、操作简便等优点，荧光素酶报告基因检测是以荧光素，可以用于研究基因表达调控机制、筛选药物和检测细胞信号通路等。

但也存在一些局限性，如需要对目标细胞进行转染处理、被测基因的上游或下游序列需要足够长等。双荧光素酶报告基因实验常被用于研究转录因子与DNA结合、靶基因的启动子区域、miRNA的调控作用、RNA剪接等生物过程，从而深入地了解基因调控的机制。

同时，该技术也可以用于鉴定抑制剂和激动剂、筛选小分子化合物、检测细胞信号通路等方面。双荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学技术，其原理简单易行，应用广泛。通过该技术可以揭示基因表达和调控的机制，在生物医学领域中具有重要的应用价值。

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称．荧光素酶及其合成基因在生物研究中有着广

报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。

在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

基因表达调控研究中主要实验技术有哪些

（1）一个完整的基因表达载体除了目的基因、标记基因和复制原点外，还应包括启动子、终止子．

（2）要获得目的基因必须在目的基因的两侧具有相应的酶切位点进行切割，图1中可以看出，BamHⅠ的酶切位点在目的基因的中间，故不可取；根据表格可以看出，SmaⅠ的识别序列中含有MspⅠ的识别序列，因此SmaⅠ在目的基因的两端进行切割．

（3）①实验设计中可以看出，本实验的自变量为荧光素酶溶液的浓度，而酶需要适宜的PH，该条件属于实验的无关变量，因此实验材料中缓冲溶液能够维持溶液pH值稳定．为使结果更加科学准确，应增设一组浓度为0mg/L的荧光素酶溶液作为空白对照．实验的无关变量还有温度、反应的时间等．

②图2可以看出，酶浓度达到400mg/L时，发光强度不再增加，因此e点所对应的荧光素酶浓度为最佳浓度．限制e、f、g点发光强度的因素主要是ATP的数量的数量是有限的．

（4）食品卫生检验中，可利用上述方法测定样品中细菌的ATP总含量，进而测算出细菌的数量，判断食品污染程度．测算的前提是每个细菌细胞中ATP的含量大致相同（且相对稳定）．

故答案为：

（1）启动子、终止子

（2）MspⅠ

（3）①维持溶液pH值稳定（或“保证荧光素酶的最适pH值”） 0?mg/L? 温度（或“反应时间”等）

②e　 ?ATP全部水解（或“ATP的数量限制”）

（4）大致相同（且相对稳定）

基因表达调控主要实验技术有：ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase

1、 ChIP实验

通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联, DNA与蛋白质之间的 Schiff键水解, 释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。

2、 RIP实验

RIP技术（RNA BindingProtein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

3 、RNA pull-down实验

使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

4 、EMSA实验

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

5、 Luciferase实验

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。

萤光生成反应通常分为以下两步：

萤光素+ ATP→ 萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+ PPi

萤光素化腺苷酸+ O2→ 氧萤光素+ AMP +光

荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、siRNA和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通路分析、难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞）的研究、RNA剪接研究。

双荧光素酶报告基因测试，是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简便。其应用广泛，可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点（包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间的相互作用）。